PPO，即多酚氧化酶，是典型的銅結(jié)合氧化酶。它在植物中以單體、二聚體和四聚體的結(jié)構(gòu)存在，且存在幾種異構(gòu)。
在大麥中，部分PPO以“潛伏”狀態(tài)存在。而在浸麥過程中，可以通過除去一些酶抑制劑、蛋白酶作用或其他一些方式，使其活性在浸麥過程中增長(zhǎng)。
在大麥發(fā)芽的過程中，PPO活性提高，對(duì)麥芽質(zhì)量產(chǎn)生了重要影響。
大麥中的多酚物質(zhì)經(jīng)過PPO的催化氧化后，具有單寧性質(zhì)，易和蛋白質(zhì)起交聯(lián)作用而沉淀出來，直接影響麥芽、麥汁的品質(zhì)，進(jìn)而影響啤酒的色澤、泡沫、風(fēng)味和非生物穩(wěn)定性。因此，研究PPO的酶學(xué)特性，不但能為選擇優(yōu)質(zhì)的啤酒大麥品種提供重要依據(jù)，而且對(duì)提高麥芽和啤酒質(zhì)量具有重要的意義。
本文，筆者以鄰苯二酚為底物，通過分光光度計(jì)法，對(duì)國(guó)產(chǎn)大麥中多酚氧化酶（PPO）的酶學(xué)特性進(jìn)行了研究，并同時(shí)建立了PPO活性測(cè)定方法，確定了大麥PPO的米氏常數(shù)Km為1.96mmol/L。
1.主要材料和儀器 1.1 主要材料：國(guó)產(chǎn)大麥
1.2 主要儀器：TS4－2型雙控雙溫糖化試驗(yàn)器（北京發(fā)酵工業(yè)研究所），756MC型紫外可見分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司），HWS－250型智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱（寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠）。
2.方法
2.1 多酚氧化酶酶液的制備
稱取200g大麥，置于250mL燒杯中，用水沖洗3至4遍，然后加水置于培養(yǎng)箱中，將培養(yǎng)箱溫度設(shè)置為16℃，加水浸麥。在大麥水分約達(dá)到38%時(shí)，結(jié)束浸麥，進(jìn)入發(fā)芽階段。培養(yǎng)24小時(shí)后，稱取10g濕麥芽，用去離子水反復(fù)沖洗5遍以上，置于研缽中搗碎，將搗碎的麥芽放入糖化杯內(nèi)，加去離子水90mL，0.2mol/L、pH5.0的醋酸－醋酸鈉緩沖液10mL，于40℃恒溫水浴保溫?cái)嚢?小時(shí)，然后過濾醪液，棄去最初的20mL濾液，保留最后得到的濾液，用以測(cè)定酶活力。
注意：在此操作過程中，所有容器均要求用去離子水沖洗至少3遍。
2.2 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇
取磷酸緩沖液2mL，加入0.2mol/L的鄰苯二酚溶液1.0mL、0.1mL，PPO濾液在室溫下迅速混合均勻，并置于比色杯中，然后在波長(zhǎng)為385nm—475nm間測(cè)定吸光值。
2.3 PPO活力的測(cè)定
0.1mL酶液與0.1mol/L的鄰苯二酚（用pH7.6檸檬酸－磷酸緩沖液配制）溶液1.0mL，在80℃下反應(yīng)3min，用2mL、20%的TCA終止反應(yīng)，于415nm下用分光光度計(jì)測(cè)定吸光值。
酶活力單位定義：上述條件下，將每分鐘ΔA值增加0.01，定義為1個(gè)酶活力單位U（絕干）。
2.4 PPO的酶學(xué)性質(zhì)
2.4.1 底物濃度與PPO活力的關(guān)系
在酶濃度一定時(shí)，配制濃度分別為2mmol/L、4mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、30mmol/L、40mmol/L、50mmol/L的鄰苯二酚溶液測(cè)定PPO活力。
2.4.2 酶濃度與PPO活力的關(guān)系
在底物濃度一定時(shí)，依次添加1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL的酶液，參照PPO活力的測(cè)定方法，測(cè)定PPO活力。
2.4.3 pH和溫度與PPO活力的關(guān)系
采用雙因素全面性實(shí)驗(yàn)方法：用檸檬酸－磷酸緩沖液制備不同pH、不同溫度的鄰苯二酚溶液，pH值分別為6.4、6.8、7.2、7.6、8.0、8.4，反應(yīng)溫度為70℃、80℃、85℃、90℃，參照PPO活力的測(cè)定方法，檢測(cè)PPO活力。
2.4.4 酶催化反應(yīng)時(shí)間的確定
參照PPO活力的測(cè)定方法，每30s測(cè)定一次吸光值，共測(cè)18次，可得到9min的PPO的酶促反應(yīng)速率曲線。
2.4.5 PPO的熱穩(wěn)定性
PPO在沸水中保溫2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min，水浴保溫至上述時(shí)間后，立即冷卻至室溫，測(cè)定PPO活力。
2.46 不同添加劑對(duì)PPO活力的影響
在反應(yīng)體系中，分別加入不同濃度的檸檬酸、抗壞血酸，參照PPO活力的測(cè)定方法來測(cè)定PPO活力。
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