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　　以啤酒酵母為原料提取β—葡聚糖，建立了一種氣相色譜測(cè)定β—葡聚糖和甘露聚糖（副產(chǎn)物）含量的方法。樣品用三氟乙酸（TFA） 進(jìn)行水解后，對(duì)水解單糖進(jìn)行乙酰化，制備成糖腈乙酰酯衍生物，然后采用中極性柱進(jìn)行氣相色譜分析，最后以外標(biāo)法定量測(cè)定。結(jié)果表明，β—葡聚糖和甘露聚糖的單糖成分經(jīng)乙酰化后能得到較好的色譜分離效果，本實(shí)驗(yàn)制備的產(chǎn)品中β—葡聚糖和甘露聚糖的含量分別為32.39%和16.82%，回收率為87.14%—101.2%，此法可準(zhǔn)確測(cè)定β—葡聚糖的含量。

　　本文借鑒了一些植物多糖中單糖組分的分析方法，采用氣相色譜法直接測(cè)定葡萄糖含量，具有分析速度快、選擇性強(qiáng)、靈敏度高和測(cè)定結(jié)果精確可靠等優(yōu)點(diǎn)，從而為啤酒酵母中β—葡聚糖含量的測(cè)定提供新參考。

    　1  材料與方法

    　1.1 材料與試劑

    　啤酒酵母廣州市珠江啤酒廠；β—葡聚糖日本ADEKA株式會(huì)社；風(fēng)味蛋白酶、Alcalase2.4L 諾維信公司；丙酮、三氟乙酸、鹽酸羥胺、吡啶、乙酸酐等天津市化學(xué)試劑一廠，分析純；標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖、甘露糖 上海源聚生物科技有限公司，分析純。

    　1.2 .1儀器與設(shè)備

    　本實(shí)驗(yàn)采用乙酰化作為衍生化方法，其反應(yīng)原理是：標(biāo)準(zhǔn)單糖和鹽酸羥胺在溶劑吡啶中加熱反應(yīng)生成糖肟，以乙酸酐作為乙酰化試劑，在加熱條件下繼續(xù)反應(yīng)，最后生成具有揮發(fā)性的糖腈乙酸酯衍生物。

    　GC—2014 氣相色譜儀配備氫火焰離子化檢測(cè)器FID ，日本島津公司；KQ—250DE 型數(shù)控超聲清洗器，昆山市超聲儀儀器有限公司；雷磁PHS—3C 精密pH 計(jì)，上海精科儀器有限公司；N—EVAP111型氮吹儀，美國(guó)Organomation公司；5804R型高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf 公司；RE—52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SHZ—D(III) 型循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

    　1.2 .2β—葡聚糖的制備

    　工藝流程：新鮮啤酒酵母→200目過篩除去啤酒花等雜質(zhì)→水洗除去剩余啤酒→離心分離→將沉淀溶于水配成反應(yīng)體系進(jìn)行自溶→加鹽破壁→堿性蛋白酶酶解→離心分離→水洗沉淀→脫色脫脂→冷凍干燥→粉碎→成品

    　操作要點(diǎn)：自溶，在pH7.0環(huán)境中，按反應(yīng)體積1%的量加入風(fēng)味蛋白酶，50℃下反應(yīng)24h；破壁，在pH10.5環(huán)境中，按反應(yīng)體積3%的量加入NaCl，攪拌混勻，80℃下保持1h；酶解，在pH10.5環(huán)境中，按反應(yīng)體積1%的量加入Alcalase2 .4L ，攪拌混勻，80℃下反應(yīng)3h。

    　1.3.1β—葡聚糖和甘露聚糖的單糖含量分析

　　方法制備的β—葡聚糖成品中可能還有些其他物質(zhì)，如甘露聚糖和蛋白質(zhì)，其中甘露聚糖是由甘露糖構(gòu)成的同一聚糖，本實(shí)驗(yàn)同時(shí)測(cè)定甘露聚糖的含量，為β—葡聚糖含量的測(cè)定提供參考。

    　準(zhǔn)確稱取10mg 固體單糖標(biāo)準(zhǔn)品（先在105 ℃下烘干至恒重）、10mg 鹽酸羥胺于1.5mL小離心管中，加入0.5mL吡啶，放入90℃水浴中加熱反應(yīng)30min，間歇振蕩。取出后冷卻至室溫，加入0.5mL乙酸酐，90℃下繼續(xù)水浴加熱反應(yīng)30min，離心后取適量上清液直接進(jìn)行氣相色譜分析。

    　1.3. 2 葡萄糖和甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

 &文章來源華夏酒報(bào)nbsp;  　準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖和甘露糖各10mg，乙酰化后，葡萄糖和甘露糖衍生物濃度同為10mg/mL，分別將此濃度葡萄糖和甘露糖衍生物按比例混合，配制成1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL和5mg/mL的混合糖液，同時(shí)做空白對(duì)照，立即進(jìn)行氣相色譜分析，記錄色譜峰面積，以其為縱坐標(biāo)，并以混合糖液中每種糖的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    　1.3.3 啤酒酵母多糖的水解和衍生化準(zhǔn)確稱取10mg多糖粉末于10mL離心試管中，加入2mL75%三氟乙酸，封管，90℃下水浴3h，間歇振蕩，待酸水解完取出，將試管接入氮吹儀在80℃下蒸干，再加入1mL甲醇再次蒸干，重復(fù)3 次，以去除殘留三氟乙酸。

    　1. 3.4 色譜條件

    　氣相色譜柱：DB—17 石英毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm，液膜厚0.25μm，Agilent) ；升溫程序：初溫為160℃，以5℃/min 升溫至180℃，再以2℃/min 升溫至210℃，保留5min ；進(jìn)樣口溫度：230℃，檢測(cè)器溫度：250℃；

    　載氣（氮?dú)猓┝魉伲?0mL/min，氫氣流速：45mL/min，空氣流速：400mL/min；分流比20：1，進(jìn)樣量1μL。

    　乙酰化后，標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖和甘露糖衍生物的氣相色譜分析結(jié)果如圖1 所示，分析表明采用糖腈乙酸酯衍生化的方法，一種單糖只對(duì)應(yīng)一種衍生化產(chǎn)物，在較低的200 ℃下即可分離出來。

    　兩種標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生物保留時(shí)間分別為14.347min和15.016min，分析表明在1. 3.4 所采用的氣相色譜條件下，混合單糖中的兩種單糖出峰時(shí)間短，峰形對(duì)稱，隔得較開，并未出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。

　　2  實(shí)驗(yàn)分析

    　2 .1 兩種標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生物的標(biāo)準(zhǔn)曲線

    　葡萄糖衍生物標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖1 ），甘露糖衍生物標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖2）。

　
    　根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖和甘露糖衍生物標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的操作步驟。從曲線趨勢(shì)來看，兩種單糖衍生物出峰面積隨著糖濃度的增大而呈線性增長(zhǎng)。

    　2 .2 樣品水解單糖乙酰化產(chǎn)物的氣相色譜分析

    　ADEKA 株式會(huì)社是日本最大的β—葡聚糖生產(chǎn)公司，這里將其進(jìn)口產(chǎn)品與本實(shí)驗(yàn)室制備的成品中葡聚糖和甘露聚糖含量進(jìn)行比較，將兩種樣品水解并乙酰化后，按與混合標(biāo)樣相同的色譜分析條件進(jìn)行氣相色譜分析，結(jié)果分別如圖4 和圖5 所示，其水解單糖保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)混合單糖的保留時(shí)間對(duì)比分析表明，水解后的兩種單糖分別為葡萄糖和甘露糖，其中葡萄糖含量較高。β—葡聚糖水解衍生化氣相色譜圖（見圖3）。

    　2 .3 啤酒酵母中β—葡聚糖和甘露聚糖的含量計(jì)算

    　根據(jù)樣品中水解后每種單糖氣相分析的峰面積，代入葡萄糖和甘露糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可算出葡萄糖和甘露糖的濃度，進(jìn)一步計(jì)算出樣品中葡萄糖和甘露糖含量，從而最終得到β—葡聚糖和甘露聚糖的含量，所有計(jì)算結(jié)果（見表1）。

    　從表1可以看出， 實(shí)驗(yàn)室制備的β—葡聚糖和甘露聚糖與日本進(jìn)口β—葡聚糖的含量都比較接近。樣品中組分測(cè)定的重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見表2 ）。

    　根據(jù)2.3測(cè)定的結(jié)果， 每10mg 樣品中β—葡聚糖和甘露聚糖含量分別為3.239mg和1.682mg，分別添加5mg葡萄糖和甘露糖進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表3所示，加標(biāo)回收率為87.14%—101.2%，說明該方法準(zhǔn)確性高， 能夠滿足檢測(cè)要求。樣品中組分的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見表3 ）。

    　3  結(jié)論

    　本實(shí)驗(yàn)建立的啤酒酵母β—葡聚糖含量的氣相色譜測(cè)定法，前處理簡(jiǎn)單、操作方便、重現(xiàn)性好、選擇性強(qiáng)、精密度高，符合實(shí)驗(yàn)室對(duì)β—葡聚糖含量測(cè)定方法的要求。

　　在這個(gè)分析過程中，要注意： 

　　第一，糖類衍生化方法要求制備簡(jiǎn)便、試劑易得，而且每種單糖要得到單一的色譜峰，這對(duì)單糖的定量分析是十分重要的；第二，色譜柱對(duì)于分離效果也很重要，在氣相條件探索過程中，比較了AC—5（非極性）和DB—17（中極性）兩種毛細(xì)管色譜柱，發(fā)現(xiàn)AC-5 出峰慢，分離不徹底，而DB—17 在較低溫度下很快就能出峰，而且不同單糖峰形對(duì)稱，分隔較開，效果很好，于是選擇DB—17作為分析色譜柱。