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    　葡萄成熟時，在果皮、果梗上都有大量的酵母菌存在，它們依靠葡萄分泌物生存，不同的酵母菌之間相互作用構(gòu)成了一個平衡體系。葡萄破碎后酵母進(jìn)入葡萄汁液中，在適當(dāng)?shù)臏囟认拢@些酵母菌將大量繁殖破壞原有的微生物平衡，這種條件下產(chǎn)生的發(fā)酵方式一般稱之為自然發(fā)酵。

　　在葡萄酒自然發(fā)酵過程中，不同的酵母發(fā)揮作用的時間不同，在發(fā)酵的初始階段由酒精耐受能力較低的非釀酒酵母來完成，如假絲酵母、克魯維酵母和漢森酵母等。研究表明，非釀酒酵母的生長有助于酒風(fēng)味的形成，特別是甘油、酯類和高級醇等物質(zhì)的產(chǎn)生對酒風(fēng)味的形成具有積極的作用，但發(fā)酵1天—3天后非釀酒酵母逐漸被酒精耐受能力較高的釀酒酵母所取代。一般認(rèn)為，釀酒酵母和非釀酒酵母的這種交替關(guān)系是由于菌種之間對外界環(huán)境的抵抗能力的差異造成的，比如酒精濃度的升高、有機酸的積累，pH的不斷降低以及營養(yǎng)物質(zhì)的消耗等，都可能造成非釀酒酵母的衰亡。

　　一些研究表明，酵母在發(fā)酵規(guī)程中產(chǎn)生的一些代謝產(chǎn)物會抑制其它菌的生長，如中長鏈脂肪酸以及糖蛋白、多肽等，小分子量的信號分子等。也有一些研究表明釀酒酵母與非釀酒酵母間的交替作用并不是由于一些有毒物質(zhì)代謝產(chǎn)物的分泌而產(chǎn)生的，而是由于在高細(xì)胞濃度下細(xì)胞間為爭奪生存空間造成的。非釀酒酵母存活時間的長短對葡萄酒風(fēng)味物質(zhì)的形成有著很大的影響。因此，找出酵母這種交替關(guān)系的形成機制成為葡萄酒釀造中一個急需解決的問題。

    　本實驗選擇葡萄皮表面一種常見的非釀酒酵母——克魯維酵母作為出發(fā)菌株，通過透析袋式發(fā)酵法，采用單因素實驗、發(fā)酵上清抑菌實驗以及雙向電泳等分析方法，考察外界環(huán)境變化對克魯維酵母生長的影響，探討克魯維酵母衰亡的原因。

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1材料與方法

    　1.1材料 釀酒酵母，克魯維酵母，均由大連工業(yè)大學(xué)菌種保藏中心提供。培養(yǎng)基采用全合成培養(yǎng)基，pH3.3，葡萄糖200g，檸檬酸6 g，DL—蘋果酸6 g，KH₂PO₄ 750mg，K₂SO₄ 500mg，MgSO₄·7H₂O 250 mg，CaCl₂·2H₂O 155mg，NaCl₂00mg，MnSO₄·H₂O 4mg ZnSO₄ 4mg，CuSO₄·5H₂O 1mg，KI 1mg, CaCl₂·6H₂O 400ug，H₃BO₃ 1mg，（NH₄）₆Mo₇O₂₄·2H₂O 1mg，NH₄Cl300mg YNB 3.3g，經(jīng)110℃、20min殺菌。

    　1.2 方法

    　1.2.1 克魯維酵母生長曲線的測定方法

    　克魯維酵母生長變化情況通過平板計數(shù)法測定：直接將菌適當(dāng)稀釋后涂布于YPDA培養(yǎng)基中（5g酵母提取物，10g蛋白胨，10g葡萄糖、瓊脂粉20g pH5.6），28℃培養(yǎng)3天，計數(shù)。

    　1.2.2 殘?zhí)堑臏y定方法

    　發(fā)酵液中殘?zhí)堑臏y定采用3，5—二硝基水楊酸法

    　1.2.3 酒精濃度的測定

    　發(fā)酵第4天酒精濃度的測定采用試劑盒法

    　1.2.4 發(fā)酵方法

    　釀酒酵母和克魯維酵母純培養(yǎng)：直接將種子液接種到預(yù)先準(zhǔn)備好的SM培養(yǎng)基中，接種濃度1×10⁴CFU/ml。

    　透析袋發(fā)酵：采用截留分子量為10kDa的透析袋，將克魯維酵母接種于透析袋內(nèi)，將釀酒酵母接種于透析袋外側(cè)，接種的濃度均為1×10⁴CFU/ml。透析袋經(jīng)110℃、20min 殺菌，每6天更換1次。

    　1.2.5 誘導(dǎo)因素的單因素實驗

    　酒精、pH對衰亡誘導(dǎo)作用的確定方法：取新鮮的SM培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)酒精度至43g/l，PH23（透析發(fā)酵第4天時的酒精濃度及pH），接入克魯維酵母，接種濃度為1×10⁴CFU/ml，28℃下靜置培養(yǎng)，觀察其生長的變化。

    　上清液對克魯維酵母衰亡的誘導(dǎo)作用：取發(fā)酵4天的透析袋外側(cè)發(fā)酵液，經(jīng)10000r/min，10min離心取上清液，然后接入克魯維酵母，接種濃度為1×10⁴CFU/ml，觀察生長狀態(tài)的變化。

    　氮源對克魯維酵母衰亡的誘導(dǎo)作用：取透析袋發(fā)酵（發(fā)酵4天的透析袋外側(cè)）發(fā)酵液，經(jīng)10000r/min，10min離心取上清液，然后加入與新鮮培養(yǎng)基相同濃度的氮源，接入克魯維酵母，接種濃度為1×10⁴CFU/ml，觀察其生長的變化。

    　釀酒酵母胞外分泌蛋白對克魯維酵母衰亡的誘導(dǎo)實驗：分別取發(fā)酵4天的釀酒酵母純培養(yǎng)和透析袋發(fā)酵（透析袋外側(cè)）發(fā)酵液，經(jīng)10000r/min，10min離心取上清液，經(jīng)截留分子量為10kDa的超濾膜濃縮約10倍，然后冷凍干燥成粉末，將粉末紫外殺菌后溶于無菌水中制成蛋白溶解液，最后將該蛋白質(zhì)溶解液分別加入到發(fā)酵4天的發(fā)酵上清液（透析袋外側(cè)）中，接入克魯維酵母，接種濃度為1×10⁴CFU/ml，并觀察生產(chǎn)狀態(tài)的變化。

    　1.2.6 雙向電泳

　　將上述蛋白質(zhì)干粉分別溶解于樣品緩沖液中，室溫下裂解1小時。將裂10000r/min 離心10min，取上清。采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)濃度。雙向電泳采文章來源華夏酒報用O'FARRELL（1975）的方法。

    　1.2.7 凝膠圖像的分析

    　使用Pdquest 8.0軟件對凝膠圖像進(jìn)行分析。

2結(jié)果

    　2.1 外界條件對非釀酒酵母生長的影響

    　為確定外界環(huán)境變化對克魯維酵母衰亡的影響，本實驗采用單因素實驗的方法研究各個因素在克魯維酵母衰亡中的作用，結(jié)果如圖1。由圖1可看出，增加培養(yǎng)基中的酒精濃度、改變培養(yǎng)基PH對克魯維酵母生長的影響比較小。

    　酒精（43g/L）的升高、pH（23）的改變并非誘導(dǎo)克魯維酵母衰亡的主要因素。與上述的2種發(fā)酵條件不同，為驗證營養(yǎng)物質(zhì)、溶氧在克魯維酵母衰亡中的作用，實驗堆第4天透析袋外側(cè)發(fā)酵液的抑菌活力進(jìn)行研究。

    　在發(fā)酵上清液中接入克魯維酵母，菌體經(jīng)短暫休整后開始衰亡，培養(yǎng)8天后完全消失。在好氧培養(yǎng)時對克魯維酵母能夠存活10天，表明溶氧的增加有一定的緩解作用，但并沒有從根本上解除上清液對菌體衰亡的誘導(dǎo)作用，說明溶解氧不是克魯維酵母衰亡的主要因素。同樣，上清液中氮源濃度的改變在克魯維酵母的衰亡中作用也較小。

    　2.2 不同發(fā)酵條件下生長曲線

    　為確定生存空間對克魯維酵母的影響，本實驗采用透析袋發(fā)酵法對克魯維酵母生長變化進(jìn)行研究。由圖2可見，克魯維酵母的生長在2種發(fā)酵條件下發(fā)生了巨大變化。透析袋發(fā)掘中克魯維酵母的生長速度明顯低于純培養(yǎng)時的生長速度。

    　而且在透析袋發(fā)酵中克魯維酵母的最高菌體數(shù)低于純培養(yǎng)，5天后，克魯維酵母菌體濃度由1×10⁷CFU/ml下降到5×10³CFU/ml。在透析袋發(fā)酵中克魯維酵母不經(jīng)穩(wěn)定期而直接進(jìn)入衰亡期，而且進(jìn)入衰亡期后細(xì)胞的衰亡速度較快，說明克魯維酵母并非自然衰亡，并非生存空間的爭奪引起死亡，而是外界因素的改變誘導(dǎo)了細(xì)胞的衰亡。

    　2.3發(fā)酵上清液胞外蛋白解析

    　綜上，可判明克魯維酵母的衰亡是由于釀酒酵母分泌的代謝產(chǎn)物引起的，因此，本研究采用雙向電泳法對釀酒酵母胞外分泌蛋白進(jìn)行了研究，確定分泌蛋白對克魯維酵母衰亡的影響。

    　由胞外蛋白圖譜可見，蛋白質(zhì)斑點較模糊，這主要是因為胞外分泌的蛋白質(zhì)一般都經(jīng)過了糖基化、磷酸化等修飾，這種修飾對后續(xù)染色產(chǎn)生了影響。

　　但釀酒酵母在純培養(yǎng)和透析袋培養(yǎng)中胞外蛋白的分泌總體上是一致的，蛋白大都分布在pH為3—5內(nèi)，但透析袋發(fā)酵下釀酒酵母產(chǎn)生了一些特異蛋白，為了驗證這些特異蛋白的抑菌活力，本實驗對透析袋培養(yǎng)和純培養(yǎng)上清液中大于10kDa的分泌蛋白進(jìn)行濃縮并添加入第4天的發(fā)酵上清液中進(jìn)行抑菌實驗。

    　在添加釀酒酵母胞外蛋白濃縮物后克魯維酵母的衰亡速度明顯加快，且透析袋發(fā)酵所產(chǎn)生分泌蛋白的誘導(dǎo)性更強。證明釀酒酵母在純培養(yǎng)的過程中分泌的一些分子量大于10kDa的蛋白質(zhì)對克魯維酵母的衰亡產(chǎn)生誘導(dǎo)作用，且透析袋發(fā)酵中克魯維酵母的存在會誘導(dǎo)釀酒酵母分泌一些特異性蛋白質(zhì)，這些特異蛋白類混合物對克魯維酵母的衰亡具有較強的誘導(dǎo)作用。

3討論

    　本實驗采用透析袋發(fā)酵法，通過單因素實驗、發(fā)酵上清液抑菌實驗以及雙向電泳等分析方法研究混菌發(fā)酵中克魯維酵母衰亡的原因。

    　結(jié)果表明，溶氧量、pH、酒精度、營養(yǎng)物質(zhì)以及生存空間的爭奪并不是其衰亡的原因，釀酒酵母在純培養(yǎng)的過程中分泌的一些分子量大于10kDa的蛋白類物質(zhì)會對克魯維酵母的衰亡產(chǎn)生誘導(dǎo)作用。而且克魯維酵母的存在會誘導(dǎo)釀酒酵母分泌一些特異性蛋白類物質(zhì)，這些特異蛋白類物質(zhì)對克魯維酵母的死亡形成誘導(dǎo)作用。

    　采用截留分子量為10kDa透析膜發(fā)酵，克魯維酵母同樣出現(xiàn)提前死亡的情況，說明釀酒酵母分泌的分子量較小的代謝產(chǎn)物對克魯維酵母的衰亡也具有誘導(dǎo)作用。綜合上述，釀酒酵母分泌的分子量小于10kDa的代謝產(chǎn)物和一些分子量超過10kDa的蛋白類物質(zhì)均對克魯維酵母等釀酒酵母的衰亡等具有誘導(dǎo)作用。

    　釀酒酵母分泌蛋白在克魯維酵母的衰亡中起到重要作用，在后續(xù)的研究中可以對一些特異性蛋白進(jìn)行分離，結(jié)合MALD—TOF/MS等技術(shù)對蛋白進(jìn)行解析，找到克魯維酵母細(xì)胞內(nèi)代謝的途徑變化，通過克魯維酵母在葡萄酒發(fā)酵過程中細(xì)胞代謝途徑的變化，解釋葡萄酒發(fā)酵過程中酵母之間交替關(guān)系形成的機制，最終為提高葡萄酒的風(fēng)味提供理論基礎(chǔ)。