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摘　 要：本研究將從濃香型白酒廠提供的酒醅中分離酵母菌，對其生理生化特性和發酵特性進行鑒定，以期獲得可以工業應用的酵母菌種。本試驗將酒醅菌液接種至YPD液體培養基中進行增菌培養，然后將增菌培養液接種至含有氯霉素的麥芽汁瓊脂培養基。經菌落特征、細胞形態、生理生化特征等方法，篩選出三株酵母菌。對三株酵母菌在30℃條件下進行發酵實驗，測酵母菌產酒精能力，并通過色譜分析測發酵液中產酯情況。

關鍵詞：白酒;酒醅;酵母菌

王友利

(江蘇御珍酒業有限公司)

白酒是我國特有的傳統蒸餾酒，在漫長的發展過程中形成了獨特的工藝和風味特征。酵母菌在原料淀粉質的糖化，酒精的生成，香氣物質的形成等方面都起著重要的作用，因此探討酵母微生物區系的變化，甚至特定發酵階段的種群結構對白酒生產都有重要的指導意義。

為了比較準確地把握發酵過程中酒醅微生物區系的演變規律，為濃香型白酒的窖池發酵機理及物質代謝過程的深入探討奠定良好的研究基礎，以便弄清發酵過程中物質變化趨勢與產品質量及成分組成之間的相關關系，更好地指導濃香型白酒的發酵生產，江南大學對醬香型白酒發酵窖池內酵母菌系的結構與功能進行了研究。本課題對濃香型窖池酒醅中微生物的分離培養、酒醅微生物的主要類群分析等方面進行了一些探索，以期為濃香型釀造機理奠定基礎。

酵母菌一般自然分布于高糖偏酸環境，適宜的生長溫度為25～30℃。酵母菌是兼性厭氧微生物，白酒發酵的主酵菌群在傳統白酒發酵過程中，當通氣充分時，酵母菌進行好氧呼吸，代謝能力強、速度快，菌體生長繁殖旺盛，在厭氧發酵階段的厭氣條件下，進行厭氧呼吸，經厭氧乙醇發酵代謝途徑，發酵產生乙醇及相關發酵產物在白酒發酵過程中，酵母菌一般在厭氧發酵的前期，產生乙醇的能力較強，但隨著發酵過程的進行，酵母菌與環境生態因子之間的相互作用，酸性物質也逐漸產生和積累，通常導致發酵環境的pH下降，進而使酵母菌生理代謝逐漸受到抑制，對發酵原料的轉化利用能力及乙醇的發酵生產能力也逐漸下降，甚至停止。

酒醅中酵母菌類以酵母菌屬為主，其次是有一定產香和產酒精能力的漢遜酵母和假絲酵母。酵母菌屬、漢遜酵母都屬原子囊菌亞綱、酵母目，假絲酵母是屬半知菌類的穩球酵母科各屬。篩選出酵母菌對酵母菌進行分析，從而得出白酒中酵母菌的種類，從而更加了解酵母菌在發酵過程中的作用。

1、材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

酵母菌采樣于江蘇御珍酒業有限公司某車間小組的酒醅。

1.1.2 培養基

富集培養基：

YPD培養基：10g酵母浸膏，20g蛋白胨，20g葡萄糖，1000mL蒸餾水，121℃，滅菌20min;

酵母菌分離培養基：

麥芽汁瓊脂培養基：麥芽膏粉130g，瓊脂15g，氯霉素0.1g，1000mL蒸餾水，121℃，滅菌20min;

碳源基礎培養基：

硫酸銨2g，硫酸鎂0.2g，磷酸二氫鈉0.5g，氯化鈣0.1g，磷酸氫二鉀0.5g，1000mL蒸餾水;

氮源基礎培養基：

磷酸二氫鉀1.36g，氯化鈣0.005g，磷酸氫二鈉2.13g，葡萄糖10g，硫酸鎂0.2g，硫酸鐵0.0005g，1000mL蒸餾水。

1.1.3 主要儀器

見表1。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌的分離

將白酒大叉10g放入50mL無菌水中，振蕩、搖勻，制備菌懸液，將菌懸液進行稀釋，按10%的接種量接種至YPD富集培養基中，在搖床中30℃，90rpm，進行12～24h的富集培養，鏡檢培養基中是否有酵母，將富集培養后的酵母進行梯度稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，吸取梯度為10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的稀釋液200μL菌懸液涂布到含有氯霉素的麥芽汁瓊脂平板上，在恒溫培養箱中30℃，培養48～72h，對酵母菌進行分離。

1.2.2 酵母菌的純化

對分離麥芽汁瓊脂平板上的菌種進行鏡檢，挑去具有酵母菌特征外形的菌落進行檢測，檢測是否為酵母。鏡檢后，挑取經鏡檢為酵母菌的平板的單菌落，進行劃線到麥芽汁瓊脂平板，在恒溫培養箱中30℃培養24h結合鏡檢，不斷進行劃線分離純化出單一酵母菌株。

1.2.3形態與培養特征

將酵母菌接種到YPD液體培養基中，在恒溫培養箱中30℃，90rpm恒溫培養1-2d，觀察是否發酵、培養液是否渾濁，是否形成環或島，是否有沉淀及沉淀松緊情況，并制成水鏡片于顯微鏡下觀察，記錄酵母的無性繁殖與細胞的形狀，將酵母菌接種在麥芽汁瓊脂培養基上，在30℃培養3～4d，觀察其菌落形態。

1.2.4酵母菌理化指標測定

(1)碳源同化實驗

鑒定同化碳源種類有葡萄糖、麥芽糖、α-乳糖、蔗糖、棉籽糖、半乳糖、淀粉纖維二糖。

將上述一定量的碳源，分別加入到氮源基礎培養基中，滅菌115℃，20min。將經活化后的酵母菌分別接種至上述含有不同碳源的培養基中，30℃條件下恒溫培養，觀察其是否生長，且生長良好。結果觀察標準：將已培養數天的試管于混合振蕩器上搖動，使內容物充分混勻。在一張白色卡片上畫一條約3/4mm 寬的線，將卡片緊靠試管，直對自然光觀察，如果能看到不連續線段的清晰邊緣，則記為+;如果溶液非常澄清，記為-，表示未有酵母生長，實驗設置三次重復，以不加碳源的培養基作為對照。

(2)氮源同化實驗

鑒定同化氮源種類為硝酸鉀、硫酸銨。

該實驗主要觀察分別以硝酸鉀、硫酸銨為唯一氮源時，酵母菌的生長情況。將氮源按照添加比例0.078%(w/w)加入到碳源基礎培養基中，滅菌115℃，20min，將活化后的酵母分別接種至含有不同氮源的培養基中，30℃條件下恒溫培養一周，結果觀察標準：將已培養數天的試管于混合振蕩器上搖動，使內容物充分混勻。在一張白色卡片上畫一條約3/4mm 寬的線，將卡片緊靠試管，直對自然光觀察，如果能看到不連續線段的清晰邊緣，則記為+;如果溶液非常澄清，記為-，表示未有酵母生長，以不加氮源的培養基作為對照，實驗設置三次重復。

1.2.5酵母菌發酵

(1)酵母菌發酵

按照發酵培養基體積的 10%的接種量，接種到發酵培養基中。具體操作如下：

①菌種在YPD斜面上30℃活化兩次，接種于裝有100mL的12°Brix麥芽汁的250mL的錐形瓶中，30℃培養12～18小時;

②發酵使用500mL三角瓶，內裝300mL發酵培養基，當細胞數目達到對數生長期時，將二級種子液接種30mL入發酵培養基中，8層紗布封口，30℃靜置培養，靜置發酵5d;

③發酵完成后測定殘醪的酒精度。并對發酵液進行處理，供后期數據的處理與分析。

(2)酒精含量測定

將待測樣品中酒精用蒸餾法餾出，采用重鉻酸鉀-分光光度法于600nm波長處測定。精蒸餾采用干燥100mL容量瓶，準確量取發酵液100mL于500ml蒸餾瓶，用50mL蒸餾水分三次沖洗容量瓶.洗液并入蒸餾瓶。連接蛇形冷卻管，用前述取樣用100mL容量瓶做接收器(外加冰浴)，開啟冷卻水緩慢加熱蒸餾，控制蒸餾速度，使蒸餾在30～40min內完成。收集餾出液，當接近100ml刻度時，取下容量瓶，蓋塞，于20℃水浴中保溫30min，再補加水至刻度，混勻備用。

(3)色譜分析

發酵液蒸餾：用干燥100mL容量瓶，準確量取發酵液100mL于500ml蒸餾瓶，用50mL蒸餾水分三次沖洗容量瓶.洗液并入蒸餾瓶。連接蛇形冷卻管，用前述取樣用100mL容量瓶做接收器(外加冰浴)，開啟冷卻水緩慢加熱蒸餾，控制蒸餾速度，使蒸餾在30～40min內完成。收集餾出液，將餾出液進行色譜分析。

色譜柱為CP-WAX57CP，毛細血管柱(長度50m，內徑0.25mm，膜厚0.2μm)，柱溫采用程序升溫，初始溫度35℃，保持8min后以4℃/min升至75℃，保持2min，繼續以15℃/min升溫至180℃，保持2min，再以10℃/min升至210℃，保持13min，以進樣量1μL/min分流進樣，分流比50:1。載氣為氮氣，進氣量25mL/min，檢測器溫度300℃。

2、結果與討論

白酒的生產以泥窖窖池為基礎，窖池中的多種微生物，特別是棲息于酒醅中的微生物左右著酒的產量和品質。酵母菌在原料淀粉質的糖化和酒精的生成，香氣物質的形成等方面都起著重要的作用，是窖池發酵三大菌群之一。

在培養基中添加抗生素等抑菌物質，可以干擾細菌細胞壁的生物合成，減少菌液中細菌含量，從而提高酵母菌分離選育效率。

本實驗采用YPD富集培養基對酵母菌進行富集培養12-24小時，于此時吸取菌液涂布于含有氯霉素的麥芽汁瓊脂培養基，抑制細菌生長，提高酵母分離效率，選取三株單菌落進行劃線，結合鏡檢純化出單菌落酵母菌，斜面低溫保存。

2.1 酵母菌的分析

2.1.1形態與培養特征

(1)平板培養特征：見圖1。

上圖為酵母菌接種在麥芽汁瓊脂培養基上，在30℃培養2d后酵母菌的平板菌落形態，由上圖知其中A1酵母菌，直徑1～4mm，圓形，乳白色，奶油狀，不透明，表面光滑，粘稠，有發酵香氣;A2酵母菌，圓形，直徑1～4mm，圓形，乳白色，奶油狀，不透明，表面光滑，粘稠，有發酵香氣;A3酵母菌，圓形，直徑1～3mm，圓形，乳白色，菌落表面干燥有褶皺，邊緣不整齊，中間凸起，無發酵香氣。